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紫外可见分光光度计 在临床检验中的发展和应用

2014-6-4 10:02:42      点击:
  关键词:紫外可见分光光度计,检验医学 l9世纪50年代,首先出现了用千目观比色法的纳氏(Nessler)比色管,不久有杜氏(Duboscq)比色计,后者一直沿用到本世的40年代。1911年,使用硒光电池的Berg比色计制成。而这种光电比色计是分光光度计的雏形和基础。本世纪3O年代看,由于秉灯、氢灯和各种棱镜,光学器材和电学器材的发展,美国Beckman公司的第~ 台分光光度计终于在1941年问世。至60年代,紫外可见光分光光度计(UV—V 计)基本上取代了光电比色计 1957年,美国Technicon公司按照Skeggs医生的方案,推出了世界上第一台自动化的临床生化分析仪。60年代以后.各种自动化分析仪层出不穷。特别是70年代起,各种分光光度计与计算机联姻,明显地扩大了仪器功能 现在,分光光度计作为综台光学、电学(尤其是计算机技术)和精密机械学的发展和应用, 已广泛应用于医学、食品、工业和农业等许多领域。其中以uV—V计系列彰响最广、应用最普遍, 并且还是其他分光光度计(如原子吸收分光光度计)的基础。紫外可见分光光度法具有仪器价格低廉适用性广泛,尤其是采用微机控制以来,该技术得到了突飞猛进的发展,成为检验医学中必备的一个常规仪器,本文将重点介绍uv—v 计的原理,结构,特点及其在临床检验医学中的发展和应用。 


一.紫外可见分光光度计的发展 (一)基本情况 
1.紫外可见分光光度计简介 1852年,比尔(Beer)参考了布给尔(Bouguer)1729年和朗伯(Lambert)在1760年所发表的文章,提出了分光光度的基本定律,即液层厚度相等时,颜色的强度与呈色溶液的浓度成比例,从而奠定了分光光度法的理论基础,这就是著名的比尔朗伯定律。1854年,杜包斯克(Duboscq)和奈斯勒(Nessler)等人将此理论应用于定量分析化学领域,并且设计了第一台比色计。到1918年,美国国家标准局制成了第一台紫外可见分光光度计。此后,紫外可见分光光度计经不断改进,又出现自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器,使光度法的灵敏度和准确度也不断 提高,其应用范围也不断扩大。 
2.原理  分子的紫外可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外可见辐射光后,发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。它是带状光谱,反映了分子中某些基团的信息。可以用标准光图谱再结合其它手段进行定性分析。 根据Lambert-Beer 定律:A=εbc,(A 为吸光度,ε 为摩尔吸光系数,为液池厚度,c 为溶液浓度)可以对溶液进行定量分析。 
3.结构 无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成,即光源、单色器、狭缝、样品池,检测器系统。 

(1)光源 
要求能提供所需波长范围的连续光谱,稳定而有足够的强度。常用的有白炽灯(钨比灯、卤钨灯等)、气体放电灯(氢灯、氘灯及氙灯等)、金属弧灯(各种汞灯)等多种。钨灯和卤钨灯发射320~2000nm连续光谱,最适宜工作范围为360~1000nm,稳定性好,用作可见光分光光度计的光源。氢灯和氘灯能发射150~4O0nm的紫外光,可用作紫外光区分光光度计的光源。红外线光源则由纳恩斯特(Nernst)棒产生。汞灯发射的不是连续光谱,能量绝大部分集中在253.6nm波长外,一般作波长校正用。

(2)分光系统(单色器) 
单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置,由棱镜或光栅构成。用玻璃制成的棱镜色散力强,但只能在可见光区工作,石棱镜工作波长范围为185~4000nm,在紫外区有较好的分辨率而且也适用于可见光区和近红外区。棱镜的特点是波长越短,色散程度越好。所以用棱镜的分光光度计,其波长刻度在紫外区可达到0.2nm,而在长波段只能达到 5肿。有的分光光系统是衍射光栅,即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线,刻线处不透光,于是通过光的干涉和衍射现象,较长的光波偏折的角度大,较短的光波偏折的角度小,因而形成光谱。 

(3)狭缝 狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙,用来调节人射单色光的纯度和强度,也直接影响分辨率。狭缝可在0~2mm宽度内调节,由于棱镜色散力随波长不同而变化,较先进的分光光度计的狭缝宽度可随波长一起调节。 

(4)比色杯 比色杯也叫样品池或比色皿,用来盛溶液,各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等,否则将产生测定误差。玻璃比色杯只适用于可见光区,在紫外区测定时要用石英比色杯。

 (5)检测器系统 有许多金属能在光的照射下产生电流,光愈强电流愈大,此即光电效应。因光照射而产生的电流叫做光电流。受光器有两种,一是光电池,二是光电管。光电池的组成种类繁多,最常用的是硒光电池。当连续照射一段时间会产生疲劳现象而使光电流下降,要在暗中放置一些时候才能恢复。因此使用时不宜长期照射,以防止光电池因疲劳而产生误差。光电管装有一个阴极和一个阳极,阴极是用对光敏感的金属(多为碱土金属的氧化物)做成。光愈强,电子放出愈多,电子是带负电的,被吸引到阳极上而产生电流。光电管产生电流很小,需要放大。分光光度计中常用电子倍增光电管,在光照射下所产生的电流比其他光电管要大得多,这就提高了测定的灵敏度。检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果,模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等,数字输出则通过模拟/数字转换装置如数字式电压表等。 

4.特点 
分光光度法对于分析人员来说,可以说是最常用和有效的工具之一。几乎每一个分析实验室都离不开紫外可见分光光度计。分光光度法具有以下主要特点。 4.1灵敏度高 
由于新的显色剂的大量合成,并在应用研究方面取得了可喜的进展,使得对元素测定的灵敏度有所推进.特别是有关多元络合物和各种表面活性剂的应用研究,使许多元素的摩尔吸光系数由原来的几万提高到数十万_6J 4.2选择性好目前已有些元素只要利用控制适当的显色条件就可直接进行光度法测定,如钴、铀、镍、铜、银、铁等元素的测定,已有比较满意的方法了。 4.3准确度高 
对于一般的分光光度法,其浓度测量的相对误差在1~3% 范围内,如采用示差分光光度法进行测量,则误差可减少到0.x%。 4.4适用浓度范围广 
可从常量(1%~50%)(尤其使用示差法)到痕量(1O一8~1O一6%)(经预富集后)。 

5分析成本低、操作简便、快速、应用广泛 
由于各种各样的无机物和有机物在紫外可见区都有吸收,因此均可借此法加以测定。到目前为止,几乎化学元素周期表上的所有元素滁少数放射性元素和惰性元素之外)均可采用此法。在国际上发表的有关分析的论文总数中,光度法约占28%,我国约占所发表论文总数的33%l 7l 8l。

二.紫外可见分光光度技术的基本应用 
1. 测定溶液中物质的含量 
可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。测定标准溶液(浓度已知的溶液)和未知液(浓度待测定的溶液)的吸光度,进行比较,由于所用吸收池的厚度是一样的。也可以先测出不同浓度的标准液的吸光度,绘制标准曲线,在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线,然后测定出未知液的吸光度,即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。含量 测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长,这样做有两个好处:(1)灵敏度大,物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异;(2)可以避免其他物质的干扰。 2.用紫外光谱鉴定化合物 
使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液,测定此溶液对每一种单色光的吸光度,然后以波长为横座标,以吸光度为纵座标绘制吸光度一波长曲线,此曲线即吸收光谱曲线。各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线,因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。一定物质在不同浓度时,其吸收光谱曲线 中,峰值的大小不同,但形状相似,即吸收高峰和低峰的波长是一定不变的。紫外线吸收是由不饱和的结构造成的,含有双键的化合物表现出吸收峰。紫外吸收光谱比较简单,同一种物质的紫外吸收光谱应完全一
致,但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外,单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构,必须与其他方法配合。紫外吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。  3.比较最大吸收波长吸收系数的一致性 
由于紫外吸收光谱只含有2~3个较宽的吸收带,而紫外光谱主要是分子内的发色团在紫外区产生的吸收,与分子和其它部分关系不大。具有相同发色团的不同分子结构,在较大分子中不影响发色团的紫外吸收光谱,不同的分子结构有可能有相同的紫外吸收光谱,但它们的吸